Геликаз-зависимая амплификация
 | Эту статью предлагается удалить. |
Гелика́з-зави́симая амплифика́ция (англ. Helicase-dependent amplificatio, HDA), также Гелика́за-зави́симая изотерми́ческая амплифика́ция, — это метод амплификации ДНК in vitro (подобно полимеразной цепной реакции), который осуществляется при постоянной температуре.
Введение
[править | править код]Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым методом амплификации ДНК in vitro для целей молекулярной биологии и биомедицинских исследований[1]. Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одноцепочечную (этап денатурации, обычно достигаемый при 95-97 °C), отжиг праймеров к одноцепочечной ДНК (этап отжига) и копирование одноцепочечной ДНК для создания новой двухцепочечной ДНК (этап удлинения, для которого требуется ДНК-полимераза), что требует проведения реакции в термоциклере. Эти настольные машины большие, дорогие и требуют больших затрат на эксплуатацию и обслуживание, что ограничивает потенциальное применение амплификации ДНК в ситуациях вне лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте расследования или при оказании помощи пациенту). Хотя ПЦР обычно ассоциируется с термоциклированием, в оригинальном патенте Mullis et al. раскрыто использование геликазы в качестве средства для денатурации двуцепочечной ДНК, что включает изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот. В естественных условиях ДНК реплицируется ДНК-полимеразами с различными вспомогательными белками, включая ДНК-геликаз, которые действуют для разделения ДНК путём раскручивания двойной спирали ДНК[2]. HDA был разработан на основе этой концепции, используя геликаз (фермент) для денатурации ДНК.
Методология
[править | править код]Нити двухцепочечной ДНК сначала разделяются ДНК-геликазой и покрываются одноцепочечной ДНК (ssDNA)-связывающими белками. На втором этапе два праймера, специфичные для конкретной последовательности, гибридизуются с каждой границей шаблона ДНК. Затем ДНК-полимеразы используются для удлинения праймеров, отжигаемых на шаблонах, для получения двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем используются в качестве субстратов ДНК-геликазами, вступая в следующий раунд реакции. Таким образом, развивается одновременная цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной целевой последовательности (схему см. в Vincent et al., 2004[3]).
Современный прогресс, преимущества и недостатки HDA
[править | править код]С момента публикации своего открытия технология HDA используется для «простого, легко адаптируемого теста на нуклеиновые кислоты для выявления Clostridium difficile»[4]. Другие применения включают быстрое обнаружение золотистого стафилококка путём амплификации и обнаружения короткой последовательности ДНК, специфичной для этой бактерии. Преимущества HDA в том, что он обеспечивает быстрый метод амплификации нуклеиновой кислоты специфической мишени при изотермической температуре, не требующий использования термоциклера. Однако исследователю требуется предварительная оптимизация праймеров, а иногда и буферов. Обычно оптимизация праймеров и буферов проверяется и достигается с помощью ПЦР, что ставит вопрос о необходимости дополнительных затрат на отдельную систему для проведения собственно амплификации. Несмотря на то, что HDA не требует использования термоциклера и, следовательно, позволяет проводить исследования в полевых условиях, большая часть работы, необходимой для выявления потенциально опасных микроорганизмов, проводится в исследовательских/больничных лабораториях. В настоящее время массовая диагностика по большому количеству образцов ещё не может быть достигнута с помощью HDA, в то время как ПЦР-реакции, проводимые в термоциклере, вмещающем многолуночные планшеты для образцов, позволяют амплифицировать и обнаружить целевую ДНК-мишень максимум из 96 образцов. Затраты на приобретение реагентов для HDA также относительно дороже, чем на реагенты для ПЦР, тем более что они поставляются в виде готового набора.
См. также
[править | править код]Примечания
[править | править код]- ↑ Saiki RK, et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487—491. doi:10.1126/science.239.4839.487. PMID 2448875.
- ↑ DNA Replication, 2nd edn. — WH Freeman and Company: New York, 1992. — ISBN 978-1-891389-44-3.
- ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (2004). "Helicase-dependent isothermal DNA amplification". EMBO Rep. 5 (8): 795—800. doi:10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID 15247927.
- ↑ Chow WH, McCloskey C, Tong Y, Hu L, You Q, Kelly CP, Kong H, Tang YW, Tang W (2008). "Application of isothermal helicase-dependent amplification with a disposable detection device in a simple sensitive stool test for toxigenic Clostridium difficile". J Mol Diagn. 10 (5): 452—8. doi:10.2353/jmoldx.2008.080008. PMC 2518740. PMID 18669881.
- ↑ United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support
Ссылки
[править | править код]- Biohelix Архивная копия от 14 декабря 2005 на Wayback Machine